آرشیو مهر ماه 1400

معرفيبيماري پاركينسون (PD) دومين بيماري شايع استاختلال پيشرونده عصبي (ماه و پاك ،2015). اگرچه مكانيسم هاي دقيق زمينه ساز PD باقي مانده استعوامل ناشناخته ، عوامل التهابي عوامل تعيين كننده اي هستندشروع PD (Forloni و همكاران ، 2021 ؛ Martin-Bastida و همكاران ، 2021).بر اين اساس ، نقش مسيرهاي پيام رساني التهابي درپاتوژنز PD به تمركز تحقيقات اخير تبديل شده است.ترشح مولكول هاي التهابي و انحطاطنورون هاي دوپامينرژيك با التهاب تنظيم مي شوندمسيرها و ممكن است بر توسعه PD تأثير بگذارد (Lee etهمكاران ، 2021). بنابراين ، درك بهتر مسيرهازمينه ساز بيماري زايي PD ، توسعه را تسهيل مي كنداستراتژي هاي جديد حفاظت عصبيگيرنده P2X4 (P2X4R) ، يك كانال يوني با ليگاند استبخشي از خانواده گيرنده هاي P2X يونوتروپيك purinergic (P2XR) ،به ATP حساس است و به عنوان يك كاتيون غير انتخابي عمل مي كندكانال اجازه مي دهد تا شار+Na ، K+، و Ca2+(Burnstock ، 2015 ؛ژانگ و همكاران ، 2020). ATP خارج سلولي به طور گسترده اي شناخته شده استبه عنوان يك انتقال دهنده عصبي منحصر به فرد يا يك انتقال دهنده انتقال دهنده مهمدر اكثر انواع عصبي P2X4R اولين دستگاه بودشناسايي گيرنده P2X در سيستم عصبي مركزي (CNS)(آنتونيولي و همكاران ، 2019). همراه با P2X1R و P2X6R ، اين گونه استدر ميان پورينرژيك هاي ATP-gated به طور گسترده اي بيان شده استگيرنده در اكثر سلولهاي عصبي و گليال (برنستوك و همكاران ،2011). P2X4 فعال سازي و مهاجرت سلول هاي ميكروگليال را تنظيم مي كند
در محل آسيب (ترانگ و همكاران ، 2020). ميكروگليا تنظيم مي كندتوليد سيتوكين و فرآيندهاي التهابي در مغز(دووو و همكاران ، 2020). افزايش سايتوكاين هاي پيش التهابيو شيميوكاين ها معمولاً حالت التهاب عصبي را تعريف مي كنند(گونزالز و همكاران ، 2014). برخي بيماريهاي عصبيبا التهاب عصبي همراه است كه در آن ميكروگليا ايجاد مي شودنقش محوري را ايفا مي كنند (مهرآبادي و صدر ، 2020 ؛ Rivers-Autyو همكاران ، 2021). در بيماران مبتلا به PD ، P2X4R ممكن است تشديد شودالتهاب در CNS با تنظيم مسيرهاي ميكروگليال(ليو و همكاران ، 2013). محور سيگنالينگ ATP-P2X4R واسطه استفعال شدن التهاب NLRP3 ATP خارج سلوليواسطه پاسخ هاي التهابي است و NLRP3 را فعال مي كندالتهابي از طريق P2X7R و P2X4R (چن و همكاران ، 2018).لامازوم NLRP3 inf از NLRP3 تشكيل شده است ،پروكاسپاز -1 و پروتئين شبه مانند مرتبط با آپوپتوزحاوي پروتئين حاوي دامنه استخدام كاسپاز(مالهوترا و همكاران ، 2020 ؛ واني و همكاران ، 2021). احساس خطر مي كندسيگنال هايي از جمله ليپوپلي ساكاريدها و سطح گلوكز بالاو سپس باعث ايجاد آبشار التهابي مي شود كه منجر به آن مي شودبرش پروكاسپاز -1 و فعال شدن اينترلوكين (IL)-1β ، IL-18 و IL-33 (پيچيني و همكاران ، 2008 ؛ جيانگ و همكاران ، 2021).
التهاب NLRP3 نقش مهمي درمكانيسم هاي مولكولي زمينه ساز بسياري از التهابات استبيماريها ، از جمله ديابت ، بيماري آلزايمر ،تصلب شرايين و نقرس (تان و همكاران ، 2013 ؛ هالبروك و همكارانهمكاران ، 2021). التهاب ممكن است به كليه نيز كمك كندالتهاب بينابيني در نفروپاتي ديابتي (Chen etهمكاران ، 2013). دوپامين ممكن است داراي اثرات ضد التهابي باشدمهار NLRP3 (يان و همكاران ، 2015). زيرا التهابي استعوامل نقش مهمي در شروع PD ، NLRP3 دارندبه احتمال زياد در بيماري زايي PD مشاركت مي كند (مائو و همكاران ،2017). بنابراين ، ما فرض كرديم كه محور ATP-P2X4Rواسطه فعال سازي التهابي NLRP3 در PD است. حالمطالعه براي تأييد اين فرضيه انجام شد.مواد و روش هاحيوانات آزمايشيدويست و چهل موش صحرايي نر بالغ ويستار 40-50 روزهسن (بدون پاتوژن خاص ، با وزن 180-200 گرم) بودندبه دست آمده از مركز تجربي حيوانات چينگدائو ،چينگدائو ، چين (شماره مجوز SCXK (لو) 2014-0001). اينپايبندي به اصول بيانيه بازلو به توصيه مutesسسات مليراهنماي بهداشت براي مراقبت و استفاده از حيوانات آزمايشگاهي(نشريه NIH شماره 8023). پروتكل مورد تأييد قرار گرفتكميته اخلاق حيوانات دانشگاه چينگدائو ، چين(تصويب شماره QYFYWZLL 26119) در 5 مارس 2015. ايزوفلوران(MilliporeSigma، St. Louis، MO، USA) براي بيهوشي استفاده شدحيوانات از طريق استنشاق
طراحي و رويه هاي آزمايشيآزمايش Iموش ها به طور تصادفي به چهار گروه درماني تقسيم شدند (n= 20 در هر گروه ؛ شكل 1). گروه كنترل: بعد از 1 هفتهقبل از درمان با 0.9 sal سالين فيزيولوژيكي ، ما تزريق كرديم0.02 acid اسيد اسكوربيك به ماده سياه نيل پارس فشرده(SNpc) بصورت كليشه اي ؛ گروه 6-هيدروكسي دوپامين (6-OHDA):پس از 1 هفته پيش درمان با 0.9 sal سالين فيزيولوژيكي ،ما 6-OHDA را به صورت كليشه اي به SNpc تزريق كرديم تا ايجاد شودPD؛ 5- (3-بروموفنيل) -1،3-دي هيدرو-2H-بنزوفورو [3،2-e] -1،4-گروه diazepin-2-one (5-BDBD): پس از 1 هفته پيش درمانبا 5-BDBD (آنتاگونيست انتخابي P2X4R) ، تزريق كرديماسيد اسكوربيك به صورت كليشه اي به SNpc وارد مي شود. و 5-BDBD +گروه 6-OHDA: پس از 1 هفته پيش درمان با 5-BDBD ، ما6-OHDA را به صورت كليشه اي به SNpc تزريق كرد.آزمايش دومموش ها به طور تصادفي به هشت گروه درماني تقسيم شدند (n= 20 در هر گروه ؛ شكل 1). گروه كنترل: پس از 1 هفته ازقبل از درمان با 0.9 sal نمك فيزيولوژيكي ، 0.02 تزريق كرديم، اسيد اسكوربيك به صورت كليشه اي به SNpc وارد مي شود. گروه 6-OHDA:پس از 1 هفته پيش درمان با 0.9 sal سالين فيزيولوژيكي ،ما 6-OHDA را به صورت كليشه اي به SNpc تزريق كرديم تا ايجاد شودPD؛ گروه P2X4R-NC: پس از 1 هفته پيش درمان با aلنتي ويروس كنترل منفي (NC) ، 0.02٪ آسكوربيك تزريق كرديماسيد را به صورت كليشه اي وارد SNpc كنيد. P2X4R-NC + 6-OHDAگروه: پس از 1 هفته پيش تيمار با كنترل منفيلنتي ويروس ، ما 6-OHDA را به صورت كليشه اي به SNpc تزريق كرديم.گروه P2X4R-RNA: پس از 1 هفته پيش درمان با aلنتي ويروس حامل P2X4R ، 0.02 درصد اسيد اسكوربيك را به داخل تزريق كرديمSNpc به صورت كليشه اي ؛ گروه P2X4R-RNA + 6-OHDA: بعد1 هفته پيش درمان با لنتي ويروس حامل P2X4R ، ماتزريق 6-OHDA به SNpc به صورت كليشه اي. P2X4R-siRNAگروه: پس از 1 هفته پيش درمان با حامل لنتي ويروسRNA كوچك تداخل (siRNA) كه P2X4R را هدف قرار مي دهد ، تزريق كرديم0.02 acid اسيد اسكوربيك به SNpc به صورت كليشه اي ؛ P2X4RsiRNA+ 6-OHDA گروه: پس از 1 هفته پيش درمان باlentivirus حمل siRNA با هدف P2X4R ، ما 6-OHDA را تزريق كرديمبه صورت كليشه اي وارد SNpc شويد.تزريق داخل مغزي بطني 5-BDBDهر موش به آرامي ، بيش از 4 دقيقه ، با 10 تزريق شدميكروگرم 5-BDBD (MilliporeSigma) در 2 ميكروليتر 0.9 diss حل شده استنمك فيزيولوژيكي داخل بطن جانبي چپ ، تعيين شدبا توجه به مختصات كليشه اي محاسبه شده با استفاده ازاطلس مغز موش ، مغز موش در مختصات Stereotaxic ،چاپ هفتم (Paxinos and Watson، 2013): posterior of قداميفونتانل ، -0.9 ميلي متر ؛ داخلي ، -1.5 ميلي متر ؛ پشتي ،3.5 ميلي متر پس از تزريق روزانه به مدت 1 هفته ، حيوانات بودندبه مدت 2 هفته يك روز در ميان تزريق مي شود. موش هاي كنترل وگروههاي 6-OHDA در آزمايش I به صورت كليشه اي تزريق شدندبا 2 ميكروليتر نمك فيزيولوژيكي 0.9.
پيش درماني با بردارهاي لنتي ويروسي حامل P2X4R ياsiRNA P2X4R را هدف قرار مي دهدموش ها تزريق (2 ميكروليتر) لنتي ويروس حامل P2X4R دريافت كردند ،lentivirus حامل siRNA است كه P2X4R يا منفي را هدف قرار مي دهدكنترل (Shanghai GeneChem Co.، Ltd.، Shanghai، China) بهSNpc با توجه به مختصات كليشه اي زير:پشت فونتانل قدامي ، -5 ميلي متر ؛ پشتي ، 7.7 ميلي متر ؛داخلي ، -2.2 ميلي متر موشهاي صحرايي در گروههاي كنترل و 6-OHDAدر آزمايش دوم 2 ميكروليتر 0.9 ste بصورت كليشه اي تزريق شدنمك فيزيولوژيكيضايعات 6-OHDAيك هفته پس از پيش درمان لنتي ويروس ، 8 ميكروگرم 6-OHDA(MilliporeSigma) در 2 ميكروليتر 0.02٪ اسيد اسكوربيك حل شده است(MilliporeSigma) به صورت كليشه اي به SNpc تزريق شدPD را تأسيس كنيد (بيگهام و همكاران ، 2021). موش هاي كنترل ، 5-BDBD ،و گروه P2X4R-NC با همان حجم تزريق شد (2μL) 0.02٪ اسيد اسكوربيك.آزمون رفتاريموشهاي صحرايي PD با آپومورفين مجروح شدند(MilliporeSigma ؛ 0.5 ميلي گرم/كيلوگرم ، داخل صفاقي) در روز 14 پس از آنجراحي شده و در كاسه هاي فولادي ضد زنگ قرار مي گيرد. تعدادچرخه چرخش در 30 دقيقه ثبت شد. نرخ براي PDموش ها بايد بيش از 7 دور در دقيقه (Liu و همكاران ، 2018) (نتايج هستنددر جدول اضافي 1 نشان داده شده است).
رنگ آميزي ايمونوفلورسانسچهار هفته پس از جراحي ، پنج موش در هر گروه قرار گرفتندعميقا با اتيل كاربامات به صورت داخل صفاقي بيهوش مي شود(شركت معرف شيميايي Sinopharm Ltd.، Shanghai، China) وبه صورت ترانسكارديال با پارافورمالدئيد 4 perf پرفيوژن مي شود. هر موشمغز برداشته شد و در 4٪ پارافورمالدئيد ثابت شد24 ساعت. بعد ، ما بافت مغزي را با ساكارز آبگيري كرديمشيب در 4 درجه سانتي گراد ما بخشهاي تاجي پيوسته ايجاد كرديم(20 ميكرومتر) از طريق SNpc با استفاده از كرايواستات انجماد (LeicaBiosystems ، Nussloch ، آلمان). بخش ها به صورت شناور آزاد نگهداري مي شدنددر محلول بافر فسفات (PBS)
بخش هايي با آنتي بادي ضد تيروزين هيدروكسيلاز (TH)(خرگوش ، 1: 2000 ، گربه # 58844S ؛ فناوري سيگنالينگ سلول ،دانورز ، MA ، ايالات متحده آمريكا). بخشها در طول شب در دماي 4 درجه سانتيگراد تكان داده شدندو سپس با 0.05٪ Tween-20 در PBS سه بار شستشو داده شد. اينبخش ها با آنتي بادي ثانويه انكوبه شدند (خرگوش ،1: 1000 ، گربه # 4413 ؛ فناوري سيگنالينگ سلول) ، تكان داده شده استدماي اتاق را به مدت 2 ساعت و سه بار با 0.05٪ شستشو دهيدبين 20 در PBS. بخش ها روي سرسره هاي شيشه اي قرار گرفتند ،با 70 گرم در ليتر بافر گليسرو فسفات مهر و موم شده و با آن شستشو داده مي شودآب مقطر. ما در مجموع هر بخش ششم را تجزيه و تحليل كرديم20 بخش ما نورونهاي TH-مثبت را در SNpc شمارش كرديماين برش ها زير ميكروسكوپ فلورسانس (Axio Imager ،LSM 800 ؛ Carl Zeiss Meditec AG ، ينا ، آلمان).روش وسترن بلاتچهار هفته پس از عمل جراحي ، هشت موش در هر گروه قرار گرفتندعميقا به صورت داخل صفاقي با اتيل كاربامات بيهوش شده است ،و SNpc مغز چپ جدا شد. بافتها بودنددر 200 ميكروليتر بافر ليز حاوي پروتئاز همگن شدو مهار كننده هاي فسفاتاز (روش ، بازل ، سوئيس). اينهموژناتها در دماي 13000 × گرم در دماي 4 درجه سانتي گراد به مدت 5 سانتريفيوژ شدنددقايق. كيت سنجش پروتئين رنگ سنج بيسينكونيك اسيد(Thermo Fisher Scientific، Waltham، MA، USA) استفاده مي شدتجزيه و تحليل غلظت پروتئين در مايع رويي پروتئيننمونه ها با بافر 20٪ 5 × بارگيري ، جوشانده ، همگن شدندبه مدت 10 دقيقه و در دماي 80- درجه سانتي گراد نگهداري مي شود.پروتئين كل (20 ميكروگرم) بر روي 10 درصد دودسيل سديم جدا شدژل هاي سولفات-پلي اكريل آميد و به روش الكتروفورز منتقل مي شودبه غشاي پلي وينيليدن دي فلورايد (Roche). اينغشاها در 5 درصد شير خشك بدون چربي در اتاق مسدود شده انددرجه حرارت به مدت 1 ساعت و با آنتي بادي اوليه انكوبه مي شوددر برابر P2X4R (خرگوش ، 1: 400 ، Cat# APR-002 ؛ آزمايشگاه هاي Alomone ،اورشليم ، اسرائيل) ، NLRP3 (خرگوش ، 1: 1000 ، گربه# 13158 ؛ سلولفناوري سيگنالينگ) ، كاسپاز -1 (خرگوش ، 1: 500 ، گربه# 3866 ؛فناوري سيگنالينگ سلول) ، IL-1β (خرگوش ، 1: 2000 ، گربه# 12703 ؛فناوري سيگنالينگ سلول) ، IL-18 (خرگوش ، 1: 1000 ، گربه# 54943 ؛فناوري سيگنالينگ سلول) و گليسرولديد 3-فسفاتدهيدروژناز (GAPDH ؛ خرگوش ، 1: 1000 ، گربه# 5174 ؛ سلولفناوري سيگنالينگ) در دماي 4 درجه سانتي گراد در طول شب. غشاهابا 0.05٪ Tween-20 در PBS شسته و انكوبه شدندبا IgG همراه با پراكسيداز ترب كوهي (خرگوش ، 1: 2000 ،گربه شماره 7074؛ فناوري سيگنالينگ سلول) در دماي اتاقبه مدت 1 ساعت. پروتئين هاي واكنش پذير تجسم شدندبا استفاده از يك واكنش روشنايي افزايش يافته (ترمو فيشرعلمي). ارزش جذب خالص براي باندهاي هدف بودبا استفاده از يك سيستم پردازش تصوير ژل (Liaoning SaiasTechnology Co. Ltd.، Shenyang، China). بيان پروتئينسطوح به عنوان نسبت چگالي نوري هدف محاسبه شدپروتئين به پروتئين GAPDH.